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離體蛙心灌流
一、【目的要求】 1、學習斯氏離體蛙心灌流法; 2、了解心肌的生理特性; 3、觀察Na+,K+,Ca2+及腎上腺素(Adr),乙酰膽堿(ACh)等對離體心臟活動的影響。
二、【原理】 將離體蛙心（失去神經(jīng)支配的蛙心）保持在適宜的環(huán)境中，在一定的時間內(nèi)仍然能夠保持節(jié)律性收縮，心臟正常的節(jié)律性活動需要一個適宜的理化環(huán)境，離體心臟也是如此，離體心臟脫離了機體的神經(jīng)支配和全身體液因素的直接影響，可以通過改變灌流液的某些成分，觀察其對心臟活動的作用。心肌細胞的自律性、興奮性、傳導性及收縮性，都與鈉、鉀及鈣等離子有關。血鉀濃度過高時（高于7.9mmol/L），心臟興奮性、自律性、傳導性及收縮性都下降，表現(xiàn)為收縮力減弱、心動過緩和傳導阻滯，嚴重時心臟可停搏于舒張期。血鈣濃度升高時，心臟收縮力增強，過高可使心室停搏于收縮期。血鈣濃度降低，心肌收縮力減弱。血中鈉離子濃度的輕微變化，對心肌影響不明顯，只有發(fā)生明顯變化時，才會影響心肌的生理特性。腎上腺素可使心率加快、傳導加快及心肌收縮力增強，乙酰膽堿則與腎上腺素的作用相反。
三、【實驗儀器】 青蛙、 常用手術器械、蛙板(或蠟盤)、蛙心夾、計算機采集系統(tǒng)、張力傳感器、支架、雙凹夾、雙針形露絲刺激電極、滴管、培養(yǎng)皿(或小燒杯)、紗布、棉線、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夾、0．65％NaCl、5％NaCI、2％CaCl2、1％KCl、1：5 000腎上腺素、1：10 000乙酰肌堿、300U／mL肝素。
四、【方法與步驟】 1、斯氏蛙心插管法 （1）一只青蛙，雙毀髓后背位置于蠟盤中，按前面的方法暴露心臟。仔細識別心臟周圍的大血管(見右圖)。在左主動脈下方穿一線，于動脈圓錐處結扎(動物個體小時，結扎位置可靠上些)。再從左右兩主動脈下方穿一線，并打一活結備用。左手提起主動脈上的結扎線，右手用眼科剪在結扎線下方、沿向心方向?qū)用}上壁剪一斜口。選擇大小適宜的蛙心套管，然后將盛有少量(套管內(nèi)2～3 cm高度)任氏液(內(nèi)加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山開口處插入動脈圓錐(見右圖)。當套管到達動脈圓錐基部時，應將套管稍稍后退，使向動脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(nèi)(于心室收縮時插入，但不可插得過深，以免心室壁堵住套管下口)。此時可見套管中血液沖人套管，并使液面隨心臟搏動而亡下移動，表明操作成功(否則需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更換新鮮任氏液。穩(wěn)定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動脈連同插入的套管用雙結扎緊(不得漏液)，再將結線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結扎線上方的血管。輕輕提起套管和心臟，看清靜脈竇的位置，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織，僅保留靜脈竇與心臟的，使心臟離體(切勿損傷靜脈竇)。用任氏液反復沖洗心室內(nèi)余血，使套管內(nèi)灌流液不再有殘留血液。保持套管內(nèi)液面高度一致(1.5～2 cm)，即可進行實驗。 （2）將插好離體心臟的套管固定在支架上，用蛙心夾夾住少許心尖部肌肉 (不可夾得過多，以免因夾破心室而漏液)。再將蛙心夾上的系線繞過一個滑輪與張力傳感器相連（如右圖）。注意：勿使灌流液滴到傳感器上。調(diào)節(jié)顯示器上心臟收縮曲線的幅度適中。
2、 實驗觀察 (1)記錄正常心搏曲線 (2)改用0．65％NaCI溶液灌流，并作好加藥標記，觀察心搏變化。待曲線 氏插管裝置出現(xiàn)明顯變化時，立即吸去套管中的灌流液，同時做好沖洗標記，并用新鮮任氏液清洗2—3次，待心搏恢復正常。注意：換液時切勿碰套管，以免影響描記曲線的基線，同時保持灌流液面一致(以下同)。 觀察可得，NaCI溶液會阻遏心臟搏動。 (3) 迅速用新鮮任氏液清洗2～3次，待心搏恢復正常。向套管內(nèi)加入1～3滴2％CaCI：溶液，觀察并記錄心搏曲線的變化。當出現(xiàn)明顯變化時，立即更換任氏液，待心搏恢復正常(如果恢復遲緩，可多次沖洗)。 (4)同法向套管中加1—2滴1％KCl溶液，記錄心搏曲線的變化。當心搏曲線變化時，同法更換灌流液，待心搏恢復正常。 (5)同法記錄套管中加入l～2滴的腎上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。 (6)同法記錄套管中加入1—2滴乙酰膽堿溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。
分析：滴加Na離子溶液后，心跳減弱，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是由于灌注液中缺乏Ca2+，當Na＋明顯增高時，膜內(nèi)外鈉離子的濃度梯度增大，因此，細胞Na離子內(nèi)流加快，去極速
度和幅度均增加，導致傳導性和自律性增高。同時，Na離子內(nèi)流的增多促進細胞內(nèi)Ca2＋
的
外運使細胞內(nèi)Ca2＋
濃度降低，因此，心肌收縮能力減弱。
3、 滴加2%CaCl溶液 分析：細胞外Ca2＋在細胞膜上對Na＋內(nèi)流有競爭性抑制作用，稱為膜屏障作用。[Ca2＋] 增高時，Na＋內(nèi)流受抑制，細胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導性均降低。[Ca2 ＋] 增高使Ca2＋內(nèi)流增多，因此慢反應細胞0期去極化加快加強，傳導性增高，而快反應細胞平臺期縮短，有效不應期縮短，復極加速。Ca2＋內(nèi)流增多，使心肌收縮能力增強。[Ca2＋ ] 降低時，所引起的變化與高鈣時相反。因此加入CaCl2后，心率減少、振幅減少，基線上移。
4、滴加1%KCl溶液分析：滴加1％KCl后的心搏曲線，曲線的頻率逐漸減小，愈來愈疏，幅度逐漸下降，zui后停止在基線處，即心臟停博于舒張狀態(tài)。因為當細胞K+濃度增高時，K+與Ca2+有競爭性拮抗作用，K+抑制細胞膜對Ca2+的轉(zhuǎn)運，使進入細胞內(nèi)Ca2+減少，心肌的興奮—收縮偶聯(lián)過程減弱，心肌收縮力降低。所以心搏曲線振幅減小。
5、 滴加1：10000腎上腺素溶液分析：滴加腎上腺素后，蛙心收縮增強，心臟舒張*，描記的心搏曲線幅度明顯增大。其作用機理是，腎上腺素可與心肌細胞膜上的B受體結合，提高心肌細胞和肌漿網(wǎng)膜Ca2+通透性，導致肌漿中Ca2+濃度增高，使心肌收縮增強。另外，腎上腺素還有降低肌鈣蛋白與Ca2+親和力，促使肌鈣蛋白對Ca2+的釋放速率增加，提高肌漿網(wǎng)膜攝取Ca2+的速度，刺激Na+與Ca2+交換，使復極期向細胞外排出Ca2+的作用加速，這樣，將使心肌舒張速度增快，整個舒張過程明顯增強。
6、 滴加1：10000乙酰膽堿溶液分析：上圖可示，蛙心收縮減弱，心率減慢，zui后出現(xiàn)蛙心停止舒張階段。其機理為：乙酰膽堿與心肌細胞膜M受體結合，一方面提高心肌細胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，將引起：1）竇房強細胞復極時K+外流增多，zui大復極電位值增大；Ik衰減過程減弱，自動除極速度減慢。這兩方面因素導致竇房自律性降低，心率減慢。2）復極過程中K+外流增加，動作電位2、3期縮短，Ca2+進入細胞內(nèi)減少，使心肌收縮減弱；另一方面乙酰膽堿可直接抑制Ca2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，進而使心肌收縮減弱。
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